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AMH結構及免疫活性原料介紹

* 來(lái)源: * 作者: admin1 * 發(fā)表時(shí)間: 2018-05-09 10:59:51 * 瀏覽: 3470

抗繆勒氏管激素(AMH),也被稱(chēng)為繆勒氏管抑制因子(MIF,繆勒氏管抑制激素(MIH),繆勒氏管抑制物質(zhì)(MIS),   是 140kDa,二聚體糖蛋白激素,是TGF-β超家族的一員。

一、背景

所有該家族的成員都是二聚體糖蛋白,在組織生長(cháng)和細胞分化中起不同的調節作用。跟家族的其他成員一樣,AMH蛋白的合成首先是作為一個(gè)大的前體,包含18個(gè)信號氨基酸序列,再加工成前激素原,最終生成同型二聚體。分泌前,成熟的激素經(jīng)歷糖基化和二聚體化,形成一個(gè)140kD的二聚體。二聚體由兩個(gè)完全一樣的70kD單體亞基,通過(guò)二硫鍵鏈接形成。每個(gè)單體由N端(即“pro”區)和C端(即“mature”區)組成。在細胞漿轉運過(guò)程中,70kDAMH的單體會(huì )在“pro”區和“mature”區間的特定位點(diǎn)水解形成兩段多肽:58kD的“pro”區和12kD的“mature”區。水解后,這兩段多肽仍會(huì )以非共價(jià)形式結合。

二、基因及蛋白組成

編碼AMH的基因位于19號染色的短臂上,AMH的氨基酸序列見(jiàn)下圖

三、早期AMH的檢測試劑

國外早期的AMH檢測試劑(如DSL/IOT/Beckman Gen II等),對不同形式的AMH(如天然、重組(加工過(guò)或為加工))有不同的親和力。這些試劑的抗體即可以結合單體AMH也可以結合二聚體AMH,無(wú)法對其有效辨別。DSL/IOT兩種試劑,由于使用不同的抗體及不同的校準品,在測定同一樣品時(shí),會(huì )得出不同的檢測結果;有研究表明,Gen II的測試結果會(huì )比DSL的低20-40%;但Gen II申報數據表明,Gen II的測試結果會(huì )比DSL的高出40%。這些數據表明,AMH在某些條件下存在形式并不穩定,且測試缺乏公認的檢測標準。這在一定時(shí)間內限制了AMH在生殖評估、科研轉化等方面的應用。

目前,國內的AMH檢測主要以Beckman Gen IIELISA結果為參考依據,如Roche cobas AMH即將檢測結果溯源至此。

四、AMH的結構

AMH由兩個(gè)完全一樣的70kD單體亞基,通過(guò)二硫鍵鏈接形成。每個(gè)單體由560個(gè)氨基酸排列而成。一般情況下,同型二聚體或其他低聚體的亞基是對稱(chēng)排列的。盡管有些例子表明,二聚體中的對稱(chēng)性是可以被破壞的。在這種情況下,一個(gè)單體上可被抗體識別的位點(diǎn),在另一條單體上可能無(wú)法被識別。目前,沒(méi)有理論或機理表明,AMH是一種對稱(chēng)性被破壞的二聚體。因此,識別一條單體上位點(diǎn)的抗體,也可以識別另一條單體上的位點(diǎn)。

通過(guò)還原劑處理,二聚體AMH二硫鍵打開(kāi),AMH會(huì )形成兩條完全一致的單體。

451氨基酸處,即—RAQRSAGA—存在水解位點(diǎn),通過(guò)蛋白酶處理,全長(cháng)AMH將分為兩段多肽,1-451氨基酸為“pro”區,452-560氨基酸為“mature”區。

水解后的AMH自發(fā)聚合,可形成非共價(jià)結合的水解-再結合形式的AMH

移除信號肽(1-18)和7個(gè)前肽,AMH會(huì )產(chǎn)生2個(gè)片段,一個(gè)有26-451氨基酸;另一個(gè)有452-560氨基酸。后者為AMHmature片段。26-451還可以繼續處理為兩個(gè)片段,一個(gè)為26-229,這里稱(chēng)為N-ter-pro區,另外的230-451這里稱(chēng)為midpro區。

 盡管目前對于AMH在臨床相關(guān)樣本中的形式尚不明確,但是已知在哺乳動(dòng)物代謝循環(huán)中可存在不同形式的AMH蛋白,在多種組織和細胞中也可確認有不同形式的AMH蛋白。

五、AMH抗體配對選擇舉例

AMH存在不同的形態(tài)。針對不同區域位點(diǎn)的抗體配對,對不同形態(tài)的AMH檢出有所不同。下圖例舉了針對不同位點(diǎn)的抗體

AB位于“pro”區,CD位于“mature”區(ABCD僅為所處區域的指示,不代表特定位點(diǎn)的抗體)。

AMH是對稱(chēng)性排列的二聚體,在夾心法ELISA中,同一抗體即可作為捕獲抗體用,也可作為檢測抗體用,如C-C(如無(wú)特殊說(shuō)明,前者均作為捕獲抗體,后者均作為檢測抗體)這一配對可作為AMHmature-mature區檢測。由于針對同一位點(diǎn),該配對的檢測不受樣本水解與否的影響。類(lèi)似的,A-A可作為AMHpro-pro區檢測。C-D可作為AMHmature-mature區檢測。A-C可作為AMHpro-mature區檢測。D-B可作為AMHmature-pro區檢測。

把每一組配對都用于試劑來(lái)測量同一樣本中AMH含量。結果如下表所示


C-C

A-A

C-D

A-C

D-B

Sample

6.553

0.369

12.012

23.525

>19

Calibrators(OD  value)

Blank

0.086

0.069

0.093

--

0.062

0.1ng/ml   AMH

0.106

0.076

0.133

--

0.08

10ng/ml   AMH

1.26

1.178

2.94

--

1.5

不同配對的試劑被認為測量樣本中不同的形態(tài)的AMHC-C測量的是全長(cháng)二聚體和mature區二聚體的AMHC-D mature-mature區檢測,測量的是全長(cháng)二聚體和單體,mature區單體和二聚體AMH。因為這一配對可檢測更多形態(tài)的AMH,所以測定的值要高于C-C的檢測。A-Cpro-mature區檢測,測量全長(cháng)二聚體和單體,不能被C-D識別的全長(cháng)和單體的AMH片段。因此,存在有的亞型可以被pro-mature檢出,但是不能被mature-mature識別。

           六、同仁心主要抗體的位點(diǎn)信息


七、同仁心抗體的試劑符合率

1發(fā)光評測數據

C9F2包被/F10G7標記

發(fā)光物質(zhì):吖啶酯

靶標血清:羅氏COBAS  (N=82)


2
層析評測數據

15A3包被/C9F2標記

發(fā)光物質(zhì):銪

靶標血清:羅氏COBAS  (N=116)

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